La Calibrazione, la Validazione, un utilizzo della regressione [calibration vs accuracy setting]

  Esiste una gran confusione fra i non addetti ai lavori intorno ai concetti di calibrazione, taratura, validazione. Invece e' molto importante definire esattamente questi termini ed usarli con proprieta' di linguaggio in relazioni, articoli, comunicazioni.

  Per prima cosa bisogna disporre di valori noti dell'analita, poi bisogna disporre di una procedura di misura nota e riproducibile, non meno importante e' un operatore addestrato con grande esperienza sullo strumento e sulla procedura. Una definizione: Often calibration involves establishing the relationship between an instrument response and one or more reference values*. Come al solito prendiamo uno dei due esempi precedenti, la spettrofotometria per descrivere i concetti.

  Per preparare i valori noti di analita, in una matrice uguale o simile a quella della misura, si possono seguire due strade:

1. Usare materiali certificati, detti anche materiali di riferimento [reference materials], che hanno valori noti e con un'accuratezza certificata per moltissime matrici. Potendo non bisognerebbe sottoporre ad alcun trattamento questi materiali prima della misura. Nel nostro esempio si acquistano soluzioni note di colorante in una matrice acquosa simile a quella di un fiume.
2. Preparare da soli le matrici contenenti l'analita che dovra' essere misurato. Nel nostro esempio si acquista il colorante in estrema purezza, si prepara con sali altrettanto puri una matrice acquosa simile per concentrazioni a quella del fiume da analizzare, si sciolgono quantita' note di colorante in questa matrice.

  Ora che abbiamo una fitta serie di concentrazioni di colorante, per il nostro esempio, possiamo misurare la risposta dello spettrofotometro cioe' l'assorbanza e trovare sia la zona lineare sia l'equazione della retta di regressione. Vista l'estrema cura nella preparazione delle soluzioni possiamo usare la regressione O.L.S. gia' vista.

  Comunque per meglio definire la calibrazione riportiamo quanto scritto dalla IUPAC, nel paragrafo (18.4.3.2) sul segnale rilevato e sulla funzione di calibrazione, reperibile sul costosissimo manuale: The calibration function is defined as the functional (not statistical) relationship for the Chemical Measurement Process (CMP), relating the expected value of the observed signal or response variable E(y) to the analyte amount x. The corresponding graphical display for a single analyte is referred to as the calibration curve. Esiste una versione OnLine!.

  Il concetto di taratura e' ben diverso. La taratura si applica ad uno strumento non ad un metodo. Non e' necessario che la misura sia eseguita su di una matrice nota anzi di solito per la taratura si usa un oggetto o un altro strumento che produce un valore noto.

  Forse si comprende il concetto di taratura con qualche esempio. Una misura di conducibilita' di una soluzione acquosa e' utile per conoscere la concentrazione totale di sali disciolti. Per la misura serve una cella con due elettrodi da immergere nella soluzione ed uno strumento che imponendo una tensione (di opportuna frequenza e valore in Volts) misuri la corrente che passa nella cella. Per la taratura dello strumento non si usa una soluzione nota ma invece un resistore campione che e' di certo molto piu' robusto e riproducibile di una soluzione.

un kit per la calibrazione di uno spettrofotometro nel range del visibile

  Una delle esercitazioni (ed uno degli esempi precedenti) e' basata sulla spettrofotometria e sarebbe meglio sottoporre lo strumento a taratura, prima.

  Anche in questo caso non si usano soluzioni ma filtri, solidi, che permettono di tarare sia la lunghezza d'onda sia l'assorbanza. Cioe' il filtro ci permette di controllare nel tempo sia la posizione del picco di assorbimento (ad una data lambda) sia l'altezza del picco (l'assorbanza). Il filtro e' molto piu' riproducibile ed affidabile, negli anni, di qualsiasi soluzione.

  I due esempi qui mostrati evidenziano che per la taratura si usano comunemente oggetti e procedure non legate alla misura ma a componenti molto stabili nel tempo, e molto accurati.

  Un altro importante concetto e' quello della validazione. Validare cioe' confermare tutto un lavoro svolto. Validare come confronto con il valore ottenuto per altra via.

  In chimica analitica la validazione e' di tutto il metodo di misura, potremmo definire un percorso:

• si raccoglie un campione, abbondante, della matrice sotto esame;
• si separa il campione, dopo averlo accuratamente omogeneizzato, in due parti nominandole casualmente a et b;
• si assegna ora a ad un metodo e b all'altro (con tecnica double-blind gia' vista);
• per il metodo da validare si misura la concentrazione dell'analita con la maggior cura possibile e utilizzando tutta la statistica fin qui appresa;
• un altro operatore con un altro metodo analitico, ben noto, misura la concentrazione di analita;
• i risultati tornano a chi ha prodotto il campione per l'elaborazione statistica;
• si ripete dal primo passaggio per un numero di volte statisticamente significativo.

  Il metodo di confronto deve essere unanimemente accettato per la misura dell'analita in quella matrice e dovrebbe fornire una accuratezza maggiore ed un L.O.D. minore di quello da validare (praticamente il Gold Standard Test, ne riparleremo).