Disegno Sperimentale [DOE, Desing of Experiment]

  Gia' sappiamo che per separare due molecole molto simili e poi valutare quantitativamente il loro contenuto nella miscela possiamo usare la High Pressure Liquid Chromatograpy, HPLC, utilizzando un opportuno rivelatore.

  Scegliamo il rivelatore in base alla nostra conoscenza della coppia di molecole, ambedue devono dare un buon segnale (assorbanza in UV/Vis, fluorescenza, conducibilita', etc.). La scelta della colonna puo' essere fatta seguendo i suggerimenti del costruttore o dalla bibliografia, in questo caso tutti suggeriscono una miscela di solventi. Ora ci mancano ancora varie scelte:

• il flusso della fase mobile, in ml/min (ma fisso per tutta l'analisi),
• la temperatura a cui far lavorare la colonna,
• il rapporto percentuale fra i due solventi,

  Dovendo provare con tante combinazioni dobbiamo anche decidere il passo con cui far variare questi valori, praticamente la "nostra" risoluzione. Si usa la bibliografia e le indicazioni del costruttore della colonna, scelte ragionevoli potrebbero essere:

• flusso di 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.25 ml/min (usiamo colonne le piu' lunghe possibili, almeno 250 mm, percio' la pressiona sale in fretta),
• temperatura a cui far lavorare la colonna (data la miscela ed i suoi componenti potremmo partire dal congelamento fino all'ebollizione, alla pressione di esercizio, step da decidere, 5 ºC ?)
• il rapporto percentuale fra i due solventi (tenendo conto della possibile immiscibilita' fra i due solventi e degli eventuali eutettici, tutti i valori ogni 5% ?)

  Finalmente facciamo qualche conto: il flusso, 5 valori; la temperatura da 5 a 70 ºC, 14 valori; il rapporto di miscela da 5 a 95%, 20 valori.

  Se il sistema non si risolve possiamo lavorare "a gradiente", con miscele ternarie, con gradienti di pressione, a temperature variabili. Ma cosi' il dominio di studio si moltiplica fino a milioni di casi possibili.

  Se dovessimo esplorare solo tutte queste combinazioni possibili avremmo 1400 valori, cioe' 1400 cromatogrammi da valutare, studiare e trovare in quale e' migliore la separazione fra i due picchi (vedi i grafici in questa slide).

  Visto che queste slide sono dedicate al campionamento potremmo, ed alcuni autori lo fanno, pensare al DOE come ad un tipo particolare di campionamento, in cui la popolazione e' 1400, la numerosita' dipende da quanto vogliamo essere accurati nel trovare la miglior combinazione e dal tempo/costo a disposizione.

  C'e' un intero settore della chemiometria che si dedica all'experimental design, interi libri, escono sempre nuovi algoritmi di calcolo, professori si sono da anni dedicati solo a quello, si conoscono consulenze milionarie nel settore. Potremmo ridurre tutto cio' ad una slide? No ne faremo un capitolo a parte.

  Giusto per comprendere le possibili implicazioni di un buon disegno sperimentale, il primo grafico mostra la presenza di due picchi, con un buon lavoro di indagine si ottiene il secondo grafico, con una piu' attenta pianificazione dell'esperimento scopriamo che in una zona completamente diversa dello spazio delle variabili i due picchi si presentano con una piccola linea di base in mezzo, cioe' quantitativi.